Oddělení transkripce a buněčné signalizace

      Oddělení transkripce a buněčné signalizace ÚLBLD se zabývá zejména transkripční regulací a některými signálními cestami v buňkách vybraných nádorových typů s důrazem na studium maligního melanomu a nádorů plic. Zabýváme se též významem epigenetických změn, zejména remodelace chromatinu, která hraje klíčovou roli v transkripci některých genů. V současné době jsou nejvíce studovány transkripční faktory MITF a GLI(1-3), kromě několika dalších. MITF je aktivátorem mnoha desítek genů v melanomových buňkách a je nutný pro jejich přežívání. Je považován za příklad tzv. „lineage addiction oncogenes“, tedy genů nutných pro vývoj určité embryonální linie, a současně nutných pro přežívání nádorů z této linie vzniklých. Tyto geny jsou tedy slibným cílem genové terapie, je-li zablokování jejich exprese či funkce specificky cíleno do nádorových buněk. V tomto směru studujeme možnosti blokování exprese/funkce faktoru MITF a též jeho některých nutných „upstream“ aktivátorů (např. chromatin-remodelující komplex SWI/SNF je pro jeho expresi zcela nezbytný). Recentně jsme též zjistili, že antiapoptotický protein survivin je regulován transkripčně u většiny studovaných nádorových linií mnoha typů nádorů pomocí signální cesty Hedgehog/GLI, která je aberantně regulována u většiny typů tumorů a podílí se na udržování nádorových kmenových buněk (GLI2 je nezbytný pro aktivovanou transkripci survivinu). Zjistili jsme, že podobně je tomu s genem SLUG (důležitým při metastazování, zatím pouze u melanomových buněk), jehož exprese je rovněž pozitivně regulována (kromě faktoru MITF) též Hedgehog/GLI signální cestou. Často je používán jako užitečný pomocný faktor při studiu transkripce adenovirový gen E1A 12S (a jeho mutované formy). E1A 12S je transkripční represor a specifický “onkogen”, protože kooperuje s několika známými onkogeny při buněčné transformaci.
      Pro budoucí kombinovanou cílenou terapii nádorů, která je považována za velmi perspektivní, jsou testovány různé kombinace známých protinádorových léčiv, která však při samostatném použití vedou v klinickém použití vždy po určité době ke vzniku rezistence a někdy i ke stavu zvanému “drug addiction”, tedy závislosti rezistentních nádorových buněk na léčivu. V takových případech je nutné lék ihned vysadit a obvykle se zvolí lék jiný, působící též jako inhibitor stejné signální dráhy. Velmi často dojde i v tomto případě ke vzniku rezistence. Trojkombinace inhibitorů komponent signálních cest (či jiných proonkogenních genů) od samotného počátku léčby téměř eliminuje možnost vzniku rezistence. Na základě znalostí nádorové biologie melanomu jsme vypracovali pět různých typů trojkombinací cílené léčby (základem byly dvě látky společné všem kombinacím, třetí látka se lišila), které byly všechny mimořádně účinné na všech testovaných buňkách lidských melanomů. Již 3.-4. den byly všechny buňky eradikovány, a to při koncentracích, kdy každá samostatná látka neměla téměř žádný účinek (s výjimkou mimořádně citlivých linií, kdy stačila k eliminaci nádorových buněk 1, popř.2 látky). Výsledky byly podány jako národní i mezinárodní patentová přihláška. Podobně nalézáme kombinace vhodných látek i pro další nádory, slibný je např. “koktejl” 4 látek ničící efektivně velmi rezistentní buňky nádorů pankreatu.
      Dále se zabýváme signálními drahami mTOR a MAPK , které kontrolují mnohé zásadní fysiologické procesy v buňce. Zjistili jsme, že v melanomových buňkách je signální dráha řízená mTORem vysoce aktivní a že inhibice aktivity nereceptorové tyrosin-kinázy Src snižuje aktivitu dráhy mTORu, podobně jako jeho specifický inhibitor rapamycin. Zjistili jsme též vysokou účinnost dasatinibu při inhibici mTOR dráhy skrze inhibici aktivity Src, aktivující Akt kinázu. Je studován i možný účinek dediferenciace jako prvotního pronádorového stimulu (např. mutace či chybění některých čistě metabolických enzymů má za následek vznik nádoru). Tyto dlouhodobější experimenty si kladou za cíl identifikovat event. incipientní nádorové buňky.
      V laboratoři se provádí množství molekulárně biologických metod (analýzy exprese genů na úrovni proteinů i RNA, včetně real time PCR, klonování DNA v bakteriích, knockdown genů pomocí shRNA plasmidů i RNAi duplexů, příprava rekombinantních proteinů, metody interakce DNA protein a protein-protein in vitro a „in vivo“, imunofluorescenční techniky včetně konfokální mikroskopie, Oddělení je vybaveno pro provádění těchto metodik, konečné analýzy některých metod jsou prováděny na jiných odděleních ústavu (real-time PCR, běžná imunofluorescence, průtoková cytometrie a další). Další techniky jsou prováděny ve spolupráci s jinými ústavy nebo jsou vzorky servisně zadány k analýze firmám, většinou v zahraničí (sekvenování), a provedení různých typů omických analýz (“microarrays” a další). Testování tumorigenicity a jejího ovlivnění in vivo se provádí na nu/nu myších v Centru pro experimentální biomodely 1.LF UK (včetně moderních zobrazovacích metod nádorů na myších). Na našem oddělení je laboratoř buněčných kultur, které tvoří základ pro většinu prováděných experimentů, zejména pro přenos genů, který je prováděn různými metodami, od zjišťování promoter-reportérových aktivit přes lipofekce plasmidů až po přenos genů, shRNA i CRISPR-Cas9 plasmidů pomocí lentivirů, dále jsou fenotypově analyzovány modifikované buňky a izolované klony. Naprostá většina kultivovaných buněk jsou lidské nádorové linie, dále norm. lidské diploidní buňky a event. myší nádorové linie.
      Oddělení má povolení pro práci s radioisotopy používanými běžně v molekulární biologii, a používání GMO (II. kategorie, práce s retroviry a lentiviry).