Oddělení transkripce a buněčné signalizace

 

      Oddělení transkripce a buněčné signalizace ÚLBLD se zabývá zejména transkripční regulací v buňkách některých nádorových typů s důrazem na studium maligního melanomu. Zabýváme se též významem epigenetických změn jako je remodelace chromatinu, která hraje klíčovou roli v transkripci některých genů. V souč. době je nejvíce studován transkripční faktor MITF, který je aktivátorem mnoha desítek genů v melanomových buňkách a je nutný pro jejich přežívání. Protože je v urč. procentu mutován i amplifikován v nádorových buňkách, je považován za příklad tzv. „lineage addiction oncogenes“, tedy genů nutných pro vývoj určité embryonální linie, a současně nutných pro přežívání nádorů z této linie vzniklých. Tyto geny jsou tedy slibným cílem budoucí genové terapie, je-li zablokování jejich exprese či funkce specificky cíleno do nádorových buněk. V tomto směru studujeme zablokování transkr. faktoru MITF a některých jeho „upstream“ aktivátorů a důsledky pro melanomové buňky (které bez MITF skutečně nepřežívají). Tento možný léčebný přístup má význam zejména proto, že na inhibici aberantně aktivních signálních cest chemickými inhibitory vzniká při léčbě velmi často dříve či později rezistence, vzhledem k propojení signálních cest. Kromě melanomu jsou studovány i buňky nádorů plic a v menší míře další nádorové buněčné typy.
     V rámci nyní řešeného grantu se dále zabýváme signálními drahami mTOR a MAPK , které kontrolují mnohé zásadní fysiologické procesy v buňce. Aktivita signální dráhy mTORu je často deregulována u lidských nemocí a může tak být významným místem pro účinné léčebné zásahy. Zjistili jsme, že v melanomových buňkách je signální dráha řízená mTORem vysoce aktivní a že inhibice aktivity nereceptorové tyrosinkinázy Src snižuje aktivitu dráhy mTORu, podobně jako jeho specifický inhibitor, rapamycin. Na rozdíl od rapamycinu inhibicí aktivity c-Src nedochází zpětným mechanizmem k aktivaci kaskád proteinkináz řízených Akt/MAPK, která je zřejmě příčinou snížení terapeutických účinků rapamycinu a jeho analogů.
     Je studován i možný účinek dediferenciace jako prvotního pronádorového stimulu (např. mu-tace či chybění některých čistě metaboliských enzymů má za následek vznik nádoru). Tyto dlouhodobější experimenty si kladou za cíl identifikovat event. incipientní nádorové buňky.
     V laboratoři se provádí množství molekulárně biologických metod (analýzy exprese genů na úrovni proteinů i RNA, včetně real time PCR, klonování DNA v bakteriích, knockdown genů pomocí shRNA plasmidů i RNAi duplexů, příprava rekombinantních proteinů, metody interakce DNA protein a protein-protein in vitro a „in vivo“, imunofluorescenční techniky, měření biochemických aktivit některých enzymů jako jsou kinázy, acetyltransferázy a další). Oddělení je vybaveno pro provádění těchto metodik, konečné analýzy některých metod jsou prováděny na jiných odděleních (real-time PCR, imunofluorescence). Další techniky jsou prováděny ve spolupráci s jinými ústavy (ÚMG AV ČR, ÚDMP 1.LF) nebo jsou vzorky servisně zadány k analýze firmám, většinou v zahraničí. Jde o metody jako sekvenování (ÚMG), a provedení různých typů microarrays. Testování tumorigenicity a jejího ovlivnění se provádí na nu/nu myších v Centru pro exp. biomodely 1.LF UK ve spolupráci s pracovníky z dalších ústavů 1.LF UK. Na oddělení je laboratoř buněčných kultur, které tvoří základ pro většinu prováděných experimentů, zejména pro přenos genů, který je prováděn různými metodami, od zjišťování promoter-reportérových aktivit přes lipofekce až po přenos genů pomocí retrovirů a lentivirů, dále je často používána selekce buněk v antibiotiku a analýza izolovaných klonů. Naprostá většina kultivovaných buněk jsou lidské nádorové linie, dále lidské diploidní buňky a myší linie, většinou nádorové.
     Oddělení je v rámci ústavu hlavním pracovištěm pro práci s radioisotopy používanými běžně v molekulární biologii pro značení DNA a proteinů. V laboratoři se řeší grantové projekty kdy pracoviště je vždy hl. řešitelským místem, t.č. jsou řešeny dva projekty. Kromě mnoha pracovišť 1.LF UK a dalších tuzemských pracovišť laboratoř spolupracuje se zahraničními pracovišti (Institut Jules Bordet, Free University Brussels a Ludwig Institute for Cancer Research, University of Oxford).